一、清洗

新采用和重新使用的培養(yǎng)器皿，都要嚴(yán)格清洗，以防各種有害物質(zhì)對培養(yǎng)細胞損害。培養(yǎng)用的塑料器皿目前主要依靠進口，均已無菌密封包裝，可直接使用。對于塑料瓶蓋或膠塞等，可水中浸泡后用2％NaOH煮沸10～20min，自來水中浸泡和蒸餾水漂洗2～3次，晾干備用。細胞培養(yǎng)中的絕大部分器皿系玻璃制品，清洗過程為以下步驟。

1. 浸泡 新使用或重復(fù)使用的玻璃器皿須經(jīng)5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質(zhì)，并消除其弱堿性。

2． 刷洗 浸泡后用軟毛刷和的洗潔精進行刷洗。

3． 酸浸 刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當(dāng)晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。將玻璃制品*浸泡入清潔液中24h。清潔液具有*酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。

4． 沖洗 浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復(fù)10次以上，不殘余任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次，烘干備用。要求干凈透明，無油煙，不能殘殘余任何有害物質(zhì)及化學(xué)藥品等。

二、消毒

1. 包裝 器材經(jīng)清洗烤干或晾干后，先應(yīng)嚴(yán)格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。

2. 消毒 消毒滅菌隨物品的不同，而采用不同的方法。

（1）紫外線：主要用于消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進無菌室前或做完實驗后，均應(yīng)開燈照射30min進行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。

（2）消毒劑：操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用碘酒、酒精消毒。無菌室內(nèi)桌椅和物體的消毒可用0.1％新潔爾滅、過氧乙酸、來蘇兒等擦拭或浸泡。實驗室、無菌室的消毒可用甲醛熏蒸（高錳酸鉀5～7.5g，加40%甲醛10～15ml，混合放入一開放容器內(nèi)，立即可見白色甲醛煙霧，房間密閉24h即可）。

（3）干熱消毒：多用于玻璃器皿消毒，干熱烤箱180℃45～60min。

（4）濕熱消毒：培養(yǎng)液、橡膠制品、塑料器皿等用68kPa（115℃）高壓滅菌10min；布類、玻璃制品、金屬器械等用103kPa（121.3℃）高壓滅菌15～20min。

（5）濾過消毒：用孔徑200～450nm大小的濾板可除去培養(yǎng)液和試劑中的細菌和霉菌等。用200nm孔徑的濾板通過兩次，可使支原體達到某種程度的去除，但不能除去病毒。濾器分為負壓和加壓式兩種。過濾的液體量很少時，可選用注射器微量濾膜濾器。

（6）60Co照射：不耐熱的塑料制品或一次性用品的滅菌可經(jīng)包裝后，用γ射線照射消毒。

三、無菌操作

無菌操作是防止污染、決定培養(yǎng)是否成功的首要條件。由于體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，在一切操作中要努力做到zui大限度的無菌。工作前對手部需清洗消毒，進無菌操作室時戴口罩和穿工作服。不能用手直接觸及已消毒器皿內(nèi)部。打開培養(yǎng)瓶前或封閉瓶口前須火焰燒灼瓶口等。

四、取材

取材應(yīng)注意無菌操作，防止污染。污染組織應(yīng)放入含兩性霉素B（2μg/ml）、青霉素（500u/ml）、鏈霉素（500μg/ml）的培養(yǎng)液中浸泡10～20min。取材后應(yīng)立即進行培養(yǎng)。如因故不能培養(yǎng)時，應(yīng)在無菌條件下，把組織塊切成1cm3大小置于培養(yǎng)液中37℃貯存。存放時間不宜超過24h。

1． 源自人體的腫瘤和其他病理組織的取材、貯存和運送須注意防止污染。

2． 取血：多采用靜脈血，注意無菌操作，如需應(yīng)用肝素等抗凝劑，也要注意消毒處理。血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液，可采用離心法分離，500～1000r／min，離心5～10min即可。

3． 動物組織：動物皮毛易隱藏微生物，且不易消毒，應(yīng)特別注意無菌操作。

五、細胞分散法

1． 機械分散 對于腦、胚胎、腫瘤等軟組織，先用組織勻漿器研磨組織，再通過細胞篩獲得單細胞懸液。

2． 胰蛋白酶消化 適合于消化間質(zhì)較少的軟組織，傳代細胞消化也常采用，是應(yīng)用較廣泛的消化酶，由于Ca2+ 和Mg2+ 對胰蛋白酶活性有一定抑制作用，因此須用不含這些離子的緩沖液配制。將組織剪成1mm3大小，置于容器中，加入30～50倍體積的0.25%胰蛋白酶液，消化30～60min。

3． 膠原酶消化 對膠原有較強的消化作用，適用消化纖維組織、上皮組織及瘤組織等。膠原酶的使用終濃度為200U/ml或0.1～0.3μg/ml，其消化作用緩和。一般將3～5倍膠原酶溶液加入已剪碎的組織塊中，數(shù)小時或10余小時后，可見組織塊逐步變小至幾乎看不見，原來澄清的消化液轉(zhuǎn)變成混懸液時，可以終止消化，如組織塊較大、細胞量較多時，可于消化期間換消化液一次。消化液經(jīng)低速離心5min后，去上清液，加入20％小牛血清培養(yǎng)液，輕輕打散細胞團，制成細胞懸液。

4． EDTA溶液分散 使用濃度為0.02%的EDTA溶液。常用于傳代細胞的消化，作用溫和，毒性小。

六、淋巴細胞分離法

取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀釋后，沿試管壁慢慢加入4ml淋巴細胞分離液之表面，勿與分離液混合。然后2000r/min水平離心20min，管內(nèi)分4層，自上而下依次為血漿、單個核細胞(位于細胞分離液上界與血漿下界的中間呈白色霧狀層)、顆粒白細胞(位于淋巴細胞分離液下界與底層紅細胞上界的交界處)和紅細胞(位于管底)。用毛細吸管沿管壁輕輕吸出的淋巴細胞層。然后用Hanks液洗兩次，每次2000r/min離心10min，zui后計數(shù)供用。

七、細胞計數(shù)

待測細胞懸液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%臺盼藍0.1ml(死細胞著色),混合后滴入血球計數(shù)板內(nèi)。于低倍鏡下計數(shù)4角的4個大方格內(nèi)的活細胞(透明未著色)總數(shù),然后用下式計數(shù):

細胞數(shù)/每毫升原液=(4大方格內(nèi)活細胞數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)

細胞存活率=(活細胞數(shù)/活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100％

在計數(shù)時遇到對大方格壓線的細胞，應(yīng)按數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右的原則進行計數(shù)。