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      細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)
    • 發(fā)布日期:2017-12-19      瀏覽次數(shù):1732
      • 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇:(1)用于生物學(xué)保種;(2)用于醫(yī)學(xué)上干細(xì)胞研究;(3)用于傳代培養(yǎng)。

        實(shí)驗(yàn)方法原理

        細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實(shí)驗(yàn)證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。

         

        實(shí)驗(yàn)材料

        細(xì)胞

        試劑、試劑盒

        D-Hanks液小牛血清培養(yǎng)液青霉素鏈霉素胰蛋白酶HClNaHCO3DMSO甘油

        儀器、耗材

        微量加樣槍吸頭離心管凍存管槍頭膠塞移液管玻璃瓶紅血球計數(shù)板記號筆醫(yī)用橡皮膏移液槍超凈工作臺離心機(jī)恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱液氮冰箱

        實(shí)驗(yàn)步驟一、材料準(zhǔn)備
         

        1.  儀器:凈化工作臺、 離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

         

        2.  玻璃器皿:吸管(彎頭、直頭)、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、廢液缸。

         

        3.  塑料器皿: 吸頭、槍頭、膠塞、移液管(10ml)、15ml離心管、凍存管(1~2ml)。

         

        4.  其他物品:微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

         

        5.  試劑:D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶(0.08%)、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO(分析純)或無色新鮮甘油。

        二、細(xì)胞凍存

         

        1.  配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

         

        2.  取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來,懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。

         

        3.  離心1 000 rpm,5 min。

         

        4.  去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,計數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×106/ml~1×107/ml。

         

        5.  將細(xì)胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml。

         

        6.  在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,凍存時間及操作者。

         

        7.  凍存:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/ min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。

         

        三、 細(xì)胞復(fù)蘇

         

        1.  從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。

         

        2.  從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細(xì)胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻。

         

        3.  離心, 1 000 rpm,5 min。

         

        4.  棄去上清液,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

         

        5.  次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

        收起 
        注意事項(xiàng)

        1.  從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存,但為對數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。

         

        2.  將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護(hù)工作,以免凍傷。
         

        3.  凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。

        其他

        一、凍存和復(fù)蘇的原則:慢凍快融

         

        當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下,可以產(chǎn)生以下變化:細(xì)胞器脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

         

        如果緩慢冷凍,可使細(xì)胞逐步脫水,細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶;相反,結(jié)晶就大,大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重結(jié)晶。

         

        二、慢凍程序

         

        1.  標(biāo)準(zhǔn)程序:采用細(xì)胞凍存器

         

        當(dāng)溫度在-25 ℃以上時,  1~2 ℃/min;

         

        當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時, 5~10 ℃/min;

         

        當(dāng)溫度達(dá)-100℃時,可迅速放入液氮中。

         

        2.  簡易程序:將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜,次晨投人液氮中。

         

        3.  傳統(tǒng)程序:冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽長期儲存。

         

        三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用

         

        在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑,能大大提高凍存效果。

         

        常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,它是一種滲透性保護(hù)劑,可迅速透入細(xì)胞,提高胞膜對水的通透性,降低冰點(diǎn),延緩凍結(jié)過程,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。

         

        四、細(xì)胞凍存方法

         

        1.  預(yù)先配制凍存液

         

        (1)10%DMSO + 細(xì)胞生長液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)

         

        (2)10%甘油+ 細(xì)胞生長液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)

         

        2.  取對數(shù)生長期細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml)。

         

        3.  加入1 ml細(xì)胞于凍存管中,密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。

         

        五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法

         

        1.  快速解凍

         

        凍存細(xì)胞從液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,輕輕搖動冷凍管,使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。

         

        2.  解凍后的細(xì)胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng),24小時后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO。

         

        3.  如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感

         

        解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑,然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

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