基本原理

凝膠過(guò)濾色譜蛋白純化法，又稱為空間排阻色譜，分子篩等。其原理是應(yīng)用蛋白質(zhì)分子量或分子形狀的差異來(lái)分離。當(dāng)樣品從色譜柱的頂端向下運(yùn)動(dòng)時(shí)，大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒從而被迅速洗脫；而較小的蛋白質(zhì)分子能夠進(jìn)入凝膠顆粒中，且進(jìn)入凝膠的蛋白在凝膠中保留時(shí)間也不同，分子量越大，流出時(shí)間就越早，zui終分離分子大小不同的蛋白質(zhì)。

通常，多數(shù)凝膠基質(zhì)是化學(xué)交聯(lián)的聚合物分子制備的，交聯(lián)程度決定凝膠顆粒的孔徑。常用的色譜基質(zhì)有：葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝膠（Bio-GelP）等。高度交聯(lián)的基質(zhì)可用來(lái)分離蛋白質(zhì)和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量緩沖液成分和鹽，而較大孔徑的凝膠可用于蛋白質(zhì)分子之間的分離。選用合適孔徑的凝膠很大程度取決于目標(biāo)蛋白的分子量和雜蛋白的分子量。

實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.凝膠介質(zhì)的選擇

凝膠介質(zhì)的選擇主要是根據(jù)待分離的蛋白和雜蛋白的分子量選擇具有相應(yīng)分離范圍的凝膠，同時(shí)還需要考慮到分辨率和穩(wěn)定性的因素。比如，如果是要將目的蛋白和小分子物質(zhì)分開(kāi)，可以根據(jù)他們分配系數(shù)的差異，選用SephadexG-25和G-50；對(duì)于小肽和低分子量物質(zhì)的脫鹽，則可以選用SephadexG-10、G-15以及Bio-GelP-2或P-4；如果是分子量相近的蛋白質(zhì)，一般選用排阻限度略大于樣品中zui高分子量物質(zhì)的凝膠。

具體凝膠過(guò)濾色譜介質(zhì)應(yīng)用如下：

2.凝膠介質(zhì)的預(yù)處理

凝膠在使用前應(yīng)用水充分溶脹（膠：水=1：10），自然溶脹的耗時(shí)較長(zhǎng)，可采用加熱的方法使溶脹加速，即在沸水浴中將凝膠升溫至沸，1~2h即可達(dá)到溶脹。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌，靜置，傾去上層混懸液，除去上清液中的凝膠碎塊，重復(fù)數(shù)次，直到上清澄清為止。

3.色譜柱的選擇

色譜柱的體積和高徑比與色譜分離效果密切相關(guān)，凝膠柱床的體積、柱長(zhǎng)和柱的直徑以及柱比的選擇必須根據(jù)樣品的數(shù)量，性質(zhì)和分離目的進(jìn)行確定。組別分離時(shí)，大多采用2~30cm長(zhǎng)的色譜柱，柱床體積為樣品溶液體積的5倍以上，柱比一般在5~10之間；而分級(jí)分離一般需要100cm左右的色譜柱，并要求柱床體積大于樣品體積25倍以上，柱比在20~100之間。

4.凝膠柱的填裝

凝膠色譜柱與其它色譜方法不同，溶質(zhì)分子與固定相之間沒(méi)有力的作用，樣品組分的分離*依賴于他們各自的流速差異。裝住時(shí)關(guān)住柱子下口，在柱內(nèi)加入約1/3柱床體積的水或緩沖液，然后沿著柱子一側(cè)將緩沖液中的凝膠攪拌均勻，緩慢并連續(xù)的一次性注入柱內(nèi)。待凝膠沉積約5厘米左右時(shí)，打開(kāi)柱子下口，控制流速在1ml/min。

5.樣品的處理與上樣

根據(jù)樣品的類型和純化分析，需要選擇合適的緩沖液，為了達(dá)到良好的分析效果，上樣量必須保持在較小的體積，一般為柱床體積的1%~5%，蛋白質(zhì)樣品上樣前應(yīng)進(jìn)行濃縮，使樣品濃度不大于4%（樣品濃度與分配系數(shù)無(wú)關(guān)），但需要注意的是，較大分子量的物質(zhì)，溶液粘度會(huì)隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動(dòng)受限，影響流速。上樣前，樣品要經(jīng)濾膜過(guò)濾或離心，除去可能堵塞色譜柱的雜質(zhì)。

6.洗脫與收集

凝膠過(guò)濾色譜的緩沖液用單一緩沖液或含鹽緩沖液作為洗脫液即可，主要考慮倆個(gè)方面的原因：蛋白的溶解性和穩(wěn)定性。所用的緩沖液要保證蛋白質(zhì)樣品在其中不會(huì)變性或沉淀，PH應(yīng)選在樣品較穩(wěn)定、溶解性良好的范圍之內(nèi)，同時(shí)緩沖液中要含有一定的鹽（NaCL），對(duì)蛋白質(zhì)起穩(wěn)定和保護(hù)作用。洗脫過(guò)程中始終保持一定的操作壓，流速不可過(guò)高，保持在0.5~3.0mL/min即可。

案例介紹

AKTA凝膠過(guò)濾色譜分離蛋白質(zhì)
材料

色譜介質(zhì)：SephacrylS-200，蛋白質(zhì)分離范圍（5~250）×103

色譜柱：XK16/60預(yù)裝柱

色譜設(shè)備：AKTAExplorer

混合樣品：含單克隆抗體，分子量180000；牛血清白蛋白（68000），溶菌酶（14000）

NaOH0.5mol/L

NaCl200mmol/L

PB20mmol/L

PH7.0緩沖液

方法

1.凝膠除菌處理
超純水沖洗柱子后，用0.5mol/LNaOH正向沖洗柱，流速3mL/min，沖洗3柱體積

2.平衡
NaOH處理完畢后，用超純水沖洗2柱體積，接著用含200mmol/LNaCl和20mmol/LPB的7.0PH緩沖液沖洗5~10倍柱體積

3.上樣
平衡完畢后，選擇樣品泵進(jìn)行上樣，上樣流速3mL/min，上樣體積為1mL4.洗脫
上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液進(jìn)行洗脫5.清洗與保存
純化結(jié)束后，用0.5mol/LNaOH反向沖洗2柱體積，沖洗時(shí)間30~60min，沖洗結(jié)束后，用超純水正向沖洗5柱體積，再用20%乙醇沖洗3柱體積，然后拆下柱子，倆端封死，低溫保存。

問(wèn)題分析和解決方案

1.色譜分離前如何凈化樣品
在色譜分離前，對(duì)樣品進(jìn)行離心和過(guò)濾，離心能除去大部分塊狀物，如果離心后樣品仍不清澈，可用濾膜過(guò)濾。由醋酸纖維薄膜或PVDF材料制成的濾膜能夠非特異性的結(jié)合少量蛋白。

2.溶液交換不*
嚴(yán)格控制上樣體積，上樣體積不超過(guò)柱體積30%。
若樣品溶液體積較多，可以分多次上樣，注意每次上樣時(shí)間間隔，可根據(jù)電導(dǎo)色譜峰確定下一次上樣時(shí)間。

3.分辨率不高

1)提高裝柱質(zhì)量，使色譜柱裝填勻?qū)崳?/p>

2)提高柱床高度；

3)控制上樣體積，zui大上樣體積不超過(guò)柱床體積5%；

4)控制樣品黏度與洗脫溶液黏度保持一致；

5)根據(jù)樣品特點(diǎn)選擇合適的洗脫溶液，調(diào)節(jié)洗脫溶液的離子強(qiáng)度或親水性；

6)選擇合適的凝膠柱（如何選擇請(qǐng)參照上文）

4.色譜峰對(duì)稱性差

1)提高裝柱質(zhì)量，裝柱勻?qū)?mdash;—若柱裝的太松，容易引起拖尾，裝的太緊，會(huì)引起前沿；

2)柱較臟，再生色譜柱

5.肩峰出現(xiàn)的原因及解決方法

1)柱床松動(dòng)，重新裝柱或反向沖洗柱

2)柱篩板堵塞，超聲清洗篩板

3)柱干裂，重新裝柱