分離純化處于重組蛋白表達(dá)的下游處理（downstreamprocessing）階段，且與上游過(guò)程緊密相聯(lián)，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)等。所以在對(duì)目的蛋白表達(dá)純化時(shí)，要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游對(duì)下游的影響。同時(shí)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過(guò)程：目的蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目的蛋白表達(dá)定位（胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和細(xì)胞外）

由上表可知選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可避免破碎細(xì)胞的步驟，而且細(xì)胞外和周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白種類較少，目的蛋白易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)重組蛋白時(shí)，重組蛋白通常是可溶性表達(dá)，但也易形成包涵體?？扇苄缘鞍淄枰獜?fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離且純度較高，但回收具有生物活性的蛋白質(zhì)卻變得相當(dāng)困難，通常需要對(duì)聚集的蛋白進(jìn)行變，復(fù)性，而通常情況下活性蛋白的得率比較低。德泰生物憑借多年的蛋白表達(dá)服務(wù)操作經(jīng)驗(yàn)和相關(guān)的技術(shù)，可以提供可溶性重組蛋白保證型服務(wù)和更高純度的上清蛋白。

分離純化原則總結(jié)：

1應(yīng)盡可能利用蛋白質(zhì)不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同技術(shù)多次純化；

2不同的蛋白在性質(zhì)上有很大區(qū)別，每一步純化步驟都應(yīng)當(dāng)充分利用目的蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)差異；

3在純化早期階段要盡量減少處理體積，方便后續(xù)純化；

4在純化后期階段，再使用造價(jià)高的純化方法，有利于純化材料的重復(fù)使用，減少再生復(fù)雜性。

色譜法分離純化蛋白質(zhì)

色譜法又稱層析法，是利用不同物理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)。所有的色譜系統(tǒng)都由倆個(gè)相組成：固定相（固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上的成分）和流動(dòng)相（水和其他溶劑）。當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過(guò)固體相時(shí)，各組分與倆相發(fā)生相互作用（吸附，溶解，結(jié)合）并因作用力的不同導(dǎo)致流出時(shí)間上的差異，分部收集流出液，可以得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到分離各組分的目的。
色譜層析分離純化蛋白質(zhì)有多種方法，包括凝膠過(guò)濾色譜，離子交換色譜，親和色譜，疏水色譜液相色譜等。其中親和色譜在重組蛋白純化中的應(yīng)用中。

親和色譜

原理

親和色譜是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有的特異性親和力，從而達(dá)到分離的目的。即將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑并填充色譜柱，使得樣品混合物流經(jīng)色譜柱時(shí)，與親和配基能結(jié)合的物質(zhì)就被選擇性地吸附下來(lái)，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當(dāng)?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。
親和色譜具有高選擇性，高分辨率和高容量的特點(diǎn)，并且親和色譜純化過(guò)程簡(jiǎn)單，迅速，且分離效率高。并且可用于純化生物大分子、稀溶液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白的貯藏、從純化分子中除去殘余污染物等。但其必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求穩(wěn)定色譜的條件，且成本較高。

實(shí)驗(yàn)案例（從E.coli中提取誘導(dǎo)表達(dá)的GST標(biāo)簽融合蛋白）

簡(jiǎn)介

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）親和標(biāo)簽是純化重組蛋白的常用方法，該方法以GST能夠偶聯(lián)在介質(zhì)上的谷胱甘肽配體結(jié)合為基礎(chǔ)。同時(shí)，帶有GST的蛋白與配體結(jié)合是可逆的，能夠在溫和，非變性的條件下通過(guò)加入還原型谷胱甘肽被洗脫下來(lái)。

材料

BL21感受態(tài)細(xì)胞PGEX表達(dá)載體LB培養(yǎng)基

Amp（氨芐青霉素）

IPTG

蛋白酶抑制劑

緩沖液1（100mmol/LTris，PH8.5，500mmol/LNaCl）

緩沖液2（100mmol/LNaAc，PH4.5，500mmol/LNaCl）
PBS緩沖液（100mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，1.8mmol/LKH2PO4）

洗脫緩沖液（50mmol/LTris，PH8.0,10mmol/LGSH）

微量紫外分光光度計(jì)超聲波破碎儀高速冷凍離心機(jī)GST柱

方法

1.載體構(gòu)建和細(xì)菌培養(yǎng)

1)采用RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因，構(gòu)建到表達(dá)載體（PGEX-4T-1）上；

2)用構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，LB平板37℃；

3)LB平板上挑取單一菌落接入5mLLB培養(yǎng)基（100ug/mLAmp）中，37℃培養(yǎng)3~5h；

4)將5mL菌液接入1LLB（100ug/mLAmp）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD60≈0.6，加入0.3mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)16h；

5)將培養(yǎng)好的菌液于5000r/min離心10min，棄去上清液，收集菌體，離心后菌體沉淀懸浮于25mLBindingbuffer中。

2.細(xì)胞破碎和蛋白分離

1)往懸浮好的菌液中加入適量蛋白抑制劑（10uL的10mg/mLantipain，10uL的10mg/mLleupeptin和1mL的1mol/LPMSF），冰浴放置；

2)超聲破碎，每個(gè)循環(huán)26次，超聲6s，間隔5s，視破碎效果共2～4個(gè)循環(huán)，破碎后的菌4℃1800r/min
離心30min，上清保持在4℃；

3)GST柱先用PBS緩沖液平衡，上樣結(jié)合30~60min，每5~10min攪拌一次，流干；

4)用2~3倍體積PBS緩沖液平衡清洗非特異性蛋白，流干，加入15mL洗脫緩沖液洗脫；

5)由于殘存少量蛋白酶，洗脫出來(lái)的目的蛋白溶液可于4℃保存幾小時(shí)；

6)SDS-PAGE檢測(cè)初步純化效果，進(jìn)行下一步純化步驟。

3.蛋白檢測(cè)和GST柱的恢復(fù)

1)用3倍柱體積的6mol/L鹽酸胍處理柱子10min；

2)用3倍柱體積的水洗柱2～3次；

3)用3倍柱體積的緩沖液1處理柱子10min；

4)用3倍柱體積的緩沖液2處理柱子10min；

5)再次重復(fù)3，4步驟倆次；

6)用3倍柱體積的水洗柱2～3次；

7)用3倍柱體積的PBS緩沖液洗柱2次；

8)往柱內(nèi)加3倍體積PBS待用。

4.問題分析及解決方案

GST標(biāo)簽蛋白不結(jié)合柱子或結(jié)合能力非常弱的原因及解決辦法原因

1)過(guò)分的機(jī)械裂解使標(biāo)簽蛋白表性，阻止結(jié)合；

2)GST標(biāo)簽蛋白在樣品中有聚集，導(dǎo)致沉淀；

3)標(biāo)簽蛋白濃度過(guò)低；

4)標(biāo)簽蛋白可能改變了GST構(gòu)相；

5)平衡時(shí)間過(guò)短。

解決方法
1)裂解過(guò)程中，采用溫和的裂解條件；

2)在細(xì)胞裂解前的緩沖液中加DTT；

3)濃縮樣品，結(jié)合能力依賴濃度；

4)可以通過(guò)降低結(jié)合的溫度來(lái)改善結(jié)果；

5)確認(rèn)至少用5倍柱體積的PH6.5~8.0的緩沖液平衡過(guò)。