空柱的準(zhǔn)備

準(zhǔn)備步驟：空柱中篩網(wǎng)需要定期用 0.5 M 的 NaOH 超聲清洗，并且用 20 % 乙醇排除氣泡，內(nèi)部接一定要確保擰緊，各個(gè)部件組裝完成后用水檢查氣密性。將空柱用柱夾固定，連接到層析儀中，保證水平和垂直，對(duì)于凝膠過濾填料的裝填，需要用水平儀檢查。
 

填料勻漿的準(zhǔn)備

反復(fù)使用的填料：需要對(duì)填料進(jìn)行再生，如果填料再生后仍然結(jié)塊明顯，攪拌后部分為絮狀或者有色素沉著，建議選用新填料。

新填料：填料儲(chǔ)存液通常為 20 % 乙醇，裝柱溶液根據(jù)填料的不同而不同，可能是水溶液，鹽溶液或者是有機(jī)溶液等。將上述已經(jīng)交換到裝柱溶液中的填料進(jìn)行勻漿，可以選用燒杯，玻棒輕攪即可，切不可用攪拌子，防止填料顆粒破碎。勻漿濃度在 50 %-70 % 之間，太稀或者太濃都會(huì)影響裝填的均一性。所需填料勻漿的體積計(jì)算公式如下圖：



倒膠及壓膠

a.用注射器將空柱下端注入 2 cm 左右高度的裝柱溶液。

b.然后將填料勻漿用玻璃棒引流，倒入空柱中，過程快速，溫和，防止有氣泡產(chǎn)生。

c.用注射器補(bǔ)充裝柱溶液至空柱頂端，使液面微微凸起于空柱上端，上端柱頭篩網(wǎng)脫氣后傾斜的插入空柱中，旋緊外層接頭及柱頭，設(shè)置柱前壓 (保護(hù)空柱) 及 Delta 壓 (保護(hù)填料) 后啟動(dòng)層析設(shè)備開始?jí)耗z。可以采用恒壓或者恒流的方式進(jìn)行壓膠（裝柱推薦流速或者壓力請(qǐng)參見填料說明書），兩者區(qū)別如下圖所示：

d.待膠面不再下降后，標(biāo)記膠面位置，暫停純化儀，擰松柱頭，下降至膠面下方3 mm左右，重新擰緊即可。
 

柱效檢測(cè)

檢測(cè)方法：

柱效是檢測(cè)裝柱質(zhì)量的指標(biāo)，也是目標(biāo)分子純化成敗的關(guān)鍵因素。柱效由理論塔板高度（HETP）及對(duì)稱因子（As）決定。柱效的測(cè)定可以用 1 % 的丙酮或者 2 M NaCl 來進(jìn)行測(cè)定，分別用 UV 280 及電導(dǎo)來進(jìn)行檢測(cè)，上樣量為柱體積的 1 % - 2 %，柱效的測(cè)定中流速請(qǐng)參見填料說明書。

結(jié)果評(píng)價(jià)：

理論塔板高度（HETP）：理想情況為 1-2 個(gè)填料粒徑大小，通常 2-4 個(gè)填料粒徑大小是非常好的情況，3-5 個(gè)填料粒徑大小也是可以接受的，當(dāng)然也取決于固有生產(chǎn)中 SOP 的要求。

對(duì)稱因子（As）：理想情況為 1，但是 0.8-1.5 也是在可接受的范圍內(nèi)。

流出峰拖尾：表明填料沒有壓實(shí)。

流出峰前傾：表明填料壓的太緊。

流出峰多峰：表明柱內(nèi)填料密度不均。