（一）基本原理

混合樣品的氣流通過固定相時，根據(jù)各組分對固定相的吸附強(qiáng)弱不同使不同成分得到分離。

利用氣相色譜層析技術(shù)做為微生物診斷的工具已成功地用于微生物的分類和鑒定。該法敏感性強(qiáng)，能夠分離和檢測到毫微克的水平。它具有快速的特點，常在數(shù)十分鐘甚至數(shù)小時就可以對傳染病做出早期診斷。其結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，但不足之處是操作中各因素不易控制，方法不易標(biāo)化等。

（二）氣相色譜儀的基本部件

1． 載氣 常用的載氣主要有氮、氬、氫和二氧化碳等。這些氣體一般都由高壓氣瓶供給。

2 ． 進(jìn)樣器 氣相色譜儀可以用于分離固相、氣相和液相標(biāo)本。液相標(biāo)本采用微升注射器穿過橡皮隔片注入，氣相標(biāo)本采用特種氣相注射器注入。

3． 譜柱及加熱爐 色譜柱一般由金屬或玻璃制成，通常采用的柱長 2m~4m ，內(nèi)徑 2mm , 毛細(xì)管柱長度可達(dá)20m ～ 150m ，內(nèi)徑為 0.2mm 。

載體一般采用惰性、多孔的固體顆粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同極性的微生物化合物，為了獲得適的分離條件，要求有不同固定相的載體。目前比較常用的載體有：聚乙二醇（ CarbOwax 20M ）、 F F A P （聚乙二醇 20M 和 2- 硝基對苯二甲酸的反應(yīng)產(chǎn)物）， OV — 17 （苯基甲基硅酮）。 OV-210 、 SE-30 （甲基硅酮）、Chromosorb G （白色硅藻土載體）等。柱加熱爐在溫度控制上是非常重要的。

4 ． 紀(jì)錄儀

5 ． 數(shù)據(jù)處理裝置 一般均附有數(shù)據(jù)處理計算機(jī)。

（三）試驗條件的選擇

1． 色譜柱的選擇 要注意極性及zui搞使用溫度，柱溫不能超過zui搞使用溫度。固定相按極性相似的原則選擇。

色譜柱的內(nèi)徑大小、長度都能影響分離率。一般而言，內(nèi)徑越小，長度越長，分離效果越好，一般柱長為 1m ～ 5m（毛細(xì)管柱則 20m ～ 100m ）。

填充劑顆粒一般采用 40 目～ 60 目， 60 目～ 80 目及 80 目～ 100 目大小。長柱子宜用粒度大些的，以減少柱壓降，短柱子則用粒度細(xì)的。

氣相色譜中固定液的含量對分離效率的影響較大。一般采用固定液與載體重量之比為 15 ︰ 100 ～ 25 ︰ 100 。采用高靈敏度的檢測器，由于進(jìn)樣量減少，固定液含量可以降至 5 ︰ 100 以下。這樣可以使用較低柱溫，從而提高柱效，縮短分析時間。但固定液用量太少會引起吸附。

2 ．柱溫選擇 柱溫選擇對分離度影響很大，常是條件選擇的關(guān)鍵。選擇的基本原則是：在使難分離的組分有盡可能好的分離高度的前提下，盡可能采取較低溫度，但以保留時間適宜及不拖尾為度。

⑴ 高沸點混合物（ 200 ℃～ 400 ℃），若需在較低的柱溫下分析，可采用低固定液配比 1 ％～ 3% ，采用高靈敏檢測器，柱溫可比沸點低 100 ℃～ 150 ℃，在 200 ℃～ 250 ℃的柱溫下分析。

⑵ 沸點＜ 300 ℃的樣品，可用 3 ％～ 25% 固定液配比。沸點越低，所用配比越高，柱溫可比平均沸點低 50 ℃至平均沸點的范圍選擇。

3 ．載體選擇 載體采用低線速時，宜用氮氣；高線速時用氫氣。柱越長，柱內(nèi)有較大壓力降，宜用氫氣。載氣采用低線速時為 20ml ～ 80ml/min 。

4 ．其它條件

⑴ 氣化室溫度及檢測室溫度選擇：氣化溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點、穩(wěn)定性以及進(jìn)樣量，一般選擇稍高于樣品沸點，但不要超過沸點 50% 以上，以防分解。檢測室溫度需高于柱溫，一般高于柱溫 30 ℃左右或與氣化室同溫。

⑵ 進(jìn)樣量：固定相在配比 15 ％～ 35% 的層析柱時，大進(jìn)樣量液體為 10μl ，氣體為 10ml 。一般樣品量液體 4μl，氣體為 0.5ml ～ 3ml ，固體小于 1mg 。

⑶ 橋電位選擇：散熱多和選擇大的橋電位，在靈敏度相同的情況下，應(yīng)盡量選擇低橋電位，以保護(hù)熱敏元件。

（四）填充柱的制備

1 ．稱取一定量的載體于蒸發(fā)皿中，加 2 倍于載體體積的低沸點溶劑（氯fang丙酮、san氯甲烷等），使之溶解。

2 ．取適量的固定液，倒入蒸發(fā)皿中，拌勻。注意應(yīng)使載體全部覆蓋在液面下，于紅外燈下緩緩加熱，不時輕輕攪拌，待溶液全部揮發(fā)。

3 ．先將柱的一端用玻璃毛輕輕堵上，接上吸濾真空泵，柱的另一端接上漏斗，將填充劑從漏斗加入，同時啟動真空泵，不時輕敲柱子各部，以使填充均勻。裝滿后，關(guān)閉真空泵，取下色譜柱，將加樣的一端也填上一小團(tuán)玻璃毛。

4 ．將柱裝入色譜柱中，在通載氣前，先將爐溫升至略高于操作溫度，保持約 1h ，以使固定液受熱熔化或粘度減小，在載體表面流布均勻，然后再通入載氣，使色譜柱在操作溫度下，通載氣數(shù)小時。

（五）樣品處理

以細(xì)菌培養(yǎng)物樣品的處理為例。

1 ．取 3 ～ 5 個菌落，接種于 2ml 含有 3% 葡萄糖 TSB 肉湯（即含胰酶 1.42% 、植物胨 0.25% 、 K₂ H PO₄0.25%NaCl 、 0.42% 的肉湯）內(nèi)， 35 ℃～ 38 ℃培養(yǎng) 3h 。

2 ．于培養(yǎng)物中加 2ml 5Mol/L H₂ SO₄ 、 H₂ O 和 CH₃ OH （ 1 ︰ 3 ︰ 16 ），混合后，再加 4ml 醋酸乙脂浸取，混勻，靜置片刻。

3 ． 4 000r/min 離心 15min ，棄沉淀。

4 ．取上清液加等量yi醚提取，收集yi醚層。

5 ．于水層中再加上述比例的 5 Mol/L H₂ SO₄ 、 H₂ O 和 CH₃ OH 混合物。

6 ．于混合物中加等量氯fang提取，分層，收集氯fang層，棄去水層。

7 ．將yi醚層與氯fang層合并，揮發(fā)濃縮至 0.01ml, 加 10μg 已二酸作內(nèi)標(biāo)物，再加 20μg 甲氯基胺－ HCl 。

8 ．于混合物中加 0.2ml 吡啶，再加 0.2ml TRI － SIL － BSA 和 0.05ml TMOS ，混勻， 60 ℃孵育 1h ，離心，去沉淀。

9 ．上清即可制譜。

（六）操作方法

1 ．按流程圖并參考儀器使用說明書，將有關(guān)設(shè)備安裝好，檢查各系統(tǒng)各接頭是否漏氣，確定無誤后，可開始操作。

2 ．打開氣流總閥門，調(diào)節(jié)表頭上的減壓閥，使氣體壓力為 22kg /cm² 左右，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓器針形閥，使載氣流速控制在所需要的流速值。

3 ．加熱色譜柱至所需的柱溫并控制此溫（根據(jù)儀器恒溫箱的性能控制溫度波動值在一定的范圍之內(nèi)，如± 0.5℃）。一般所用的柱溫是在被分析物質(zhì)的平均沸點左右或更低一些。若被分析物的沸程太寬，則可用程序升溫法來升高柱溫。

4 ．加熱進(jìn)樣器（氣化室），使溫度高于樣品沸點的zui搞組分的沸點。

5 ．加熱檢測器恒溫箱，使溫度與柱溫一樣或高于一定的值。

6 ．氣流和溫度均達(dá)穩(wěn)定后，給檢測器通電流。若采用氫火焰離子化檢測器則啟動微電流放大器部分。

7 ．調(diào)檢樣器為零點，待穩(wěn)定后，即可開始進(jìn)樣。

（七）結(jié)果分析

氣相色譜層析是一種分離分析的方法，因此它的特點是適合于多組分混合物的定性和定量分析。

1 ．定性 對于一已知范圍的混合物，用此法定性很容易，但對于范圍未知的混合物來說，則需要配合化學(xué)分析及其它儀器分析等。

⑴ 利用保留值定性法：同一種物質(zhì)在一根層析柱上保留時間相同。取樣品各可能組分的純物質(zhì)加入樣品中，混合進(jìn)樣，對此加入后的色譜圖，若某色譜峰相對譜高，則該色譜峰的組分與純物質(zhì)可能為同一物質(zhì)。

⑵ 化學(xué)反應(yīng)定性法：即把色譜柱的流出物，通過官能團(tuán)試劑中，觀察試劑的顏色是否發(fā)生變化或是否有沉淀，而判斷該組分含什么官能團(tuán)或?qū)儆诤晤惢衔铩?/span>

⑶ 兩譜聯(lián)用定性法：即利用質(zhì)譜儀、紅外分光光度計等來進(jìn)行測定，定性。

2 ．定量 在實驗條件恒定時，峰面積或峰高與組分的含量成正比，因此可以利用峰面積或峰高面積或峰高來進(jìn)行定量。對于微生物標(biāo)本的氣相色譜分析常根據(jù)以下幾點來進(jìn)行比較。

⑴ 峰的有無和峰的大小。

⑵ 按 10 個重復(fù)標(biāo)本分析計算的平均 t 值（標(biāo)準(zhǔn)差）。

⑶ 同標(biāo)準(zhǔn)化合物的相對保留時間進(jìn)行對比，而對某化合物做出鑒定。