基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度科技進(jìn)展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡(jiǎn)稱，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡(jiǎn)稱。CRISPR/Cas初是在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌用來(lái)識(shí)別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。 

即將過(guò)去的7月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發(fā)現(xiàn)呢？小編梳理了一下這個(gè)月生物谷報(bào)道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

1.Science：治療鐮狀細(xì)胞疾病有戲！抑制蛋白激酶HRI可提高紅細(xì)胞中的胎兒血紅蛋白水平
doi:10.1126/science.aao0932

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)費(fèi)城兒童醫(yī)院、賓夕法尼亞大學(xué)和賓夕法尼亞州立大學(xué)的研究人員鑒定出一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞中的血紅蛋白產(chǎn)生的關(guān)鍵蛋白，從而為在未來(lái)開發(fā)出治療鐮狀細(xì)胞疾病（sickle cell disease, SCD）的創(chuàng)新性藥物提供了一種潛在的靶標(biāo)。在體外培 養(yǎng)的人體細(xì)胞中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明阻斷這種蛋白能夠降低讓紅細(xì)胞形狀扭曲的特征性鐮刀形狀。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月20日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Domain-focused CRISPR screen identifies HRI as a fetal hemoglobin regulator in human erythroid cells”。論文通信作者為費(fèi)城兒童醫(yī)院的Gerd A. Blobel博士和賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的Junwei Shi博士。
 

圖片來(lái)自Wikipedia/Illustration from Anatomy & Physiology。

導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞疾病的突變存在于成人形式的血紅蛋白中，這就是這種疾病僅影響出生后的患者的原因。這種突變導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)出異常的新月形狀，阻塞血管和損害器官，從而造成痛苦的有時(shí)甚至是危及生命的結(jié)果。血液學(xué)家早就知道相比于成人血紅蛋白，具有較高比例 的胎兒血紅蛋白的鐮狀細(xì)胞疾病患者具有較輕的癥狀。增加胎兒血紅蛋白比例的藥物羥基脲是當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但它并不適用于所有患者。因此，在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員尋求一種改進(jìn)的療法。

Blobel和Shi依靠一種使用CRISPR基因編輯技術(shù)的篩選工具。Shi之前開發(fā)出這種工具來(lái)研究基因的特定功能性結(jié)構(gòu)域，而不會(huì)干擾整個(gè)基因的功能。在這種特定的篩選中，這些研究人員著重關(guān)注一類包含蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域，這些蛋白激酶潛在地可通過(guò)小分子加以抑制。 這種篩選使得這些研究人員發(fā)現(xiàn)HRI是一種有助于抑制成人紅細(xì)胞中胎兒血紅蛋白產(chǎn)生的激酶。此外，通過(guò)鑒定出一種受到HRI調(diào)節(jié)的已知抑制胎兒血紅蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，他們的研究有助認(rèn)識(shí)HRI如何抑制胎兒血紅蛋白產(chǎn)生。當(dāng)他們選擇性地移除HRI的功能時(shí)，他們提高了 紅細(xì)胞中的胎兒血紅蛋白水平。

在這些概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，Blobel和Shi進(jìn)一步研究了當(dāng)與其他的旨在提高胎兒血紅蛋白產(chǎn)生的藥物聯(lián)合使用時(shí)，一種抑制HRI的候選藥物是否可能是更加有效的。這些研究人員將HRI移除與泊馬度胺（pomalidomide）處理聯(lián)合使用，其中已知泊馬度胺是一種增加胎兒血紅蛋 白產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)性藥物。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，聯(lián)合使用HRI移除和泊馬度胺要比單獨(dú)使用HRI移除或泊馬度胺具有更強(qiáng)的效果，這就支持對(duì)鐮狀細(xì)胞疾病進(jìn)行聯(lián)合治療的想法。

2.Cell：利用CRISPRi技術(shù)繪制人細(xì)胞中的基因相互作用圖譜
doi:10.1016/j.cell.2018.06.010

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的研究人員使用一種基于CRISPR的高通量技術(shù)快速地繪制人細(xì)胞中將近500個(gè)基因的功能圖譜，其中的許多基因之前從未被詳細(xì)地研究過(guò)。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月19日在線發(fā)表在Cell期刊上，論文標(biāo)題為“Mapping the Genetic Landscape of Human Cells”。

這項(xiàng)研究產(chǎn)生了大量新的遺傳數(shù)據(jù)，包括鑒定出參與細(xì)胞能量產(chǎn)生的新基因，并解釋了為何一些膽固醇藥物可用于治療骨質(zhì)疏松癥而相關(guān)藥物沒有這種效果的長(zhǎng)期謎團(tuán)。但是，這些研究人員說(shuō)，一個(gè)為重要的研究結(jié)果就是這項(xiàng)研究展示了一個(gè)用于繪制人細(xì)胞中基因功能的新框架，而且他們希望這終擴(kuò)展到整個(gè)人類基因組。

在這項(xiàng)新研究中，Horlbeck及其同事門對(duì)之前的實(shí)驗(yàn)中揭示的與細(xì)胞生長(zhǎng)和存活相關(guān)的472個(gè)基因進(jìn)行了基因相互作用圖譜分析。為此，他們使用了一種被稱作CRISPR抑制（CRISPR inhibition, CRISPRi）的工具。CRISPRi是CRISPR基因編輯系統(tǒng)的一個(gè)改進(jìn)版本，能夠在不編輯DNA本身的情況下降低基因活性。CRISPRi是Weissman實(shí)驗(yàn)室在2013年開發(fā)出來(lái)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的，而且2016年，Weissman實(shí)驗(yàn)室利用它破解非編碼RNA分子的功能（Science, doi:10.1126/science.aah7111）。 

這些研究人員利用CRISPRi系統(tǒng)性地讓兩種不同白血病細(xì)胞系中的成對(duì)基因---一種細(xì)胞系代表急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）和另一種細(xì)胞系代表慢性髓性白血?。–ML）---滅活，同時(shí)測(cè)量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。由此產(chǎn)生的111628個(gè)*的雙基因相互作用圖譜允許這些研究人員根據(jù)它們彼此之間的關(guān)系將472個(gè)基因分為不同的基因簇，并為這些基因簇分配功能意義，比如特定的生物通路或在細(xì)胞內(nèi)的位置。

3.兩篇Cell發(fā)現(xiàn)噬菌體抱團(tuán)抑制細(xì)菌CRISPR免疫系統(tǒng)，有助改進(jìn)噬菌體療法
doi:10.1016/j.cell.2018.06.013; doi:10.1016/j.cell.2018.05.058

CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的簡(jiǎn)稱。它是旨在抵御外來(lái)DNA的細(xì)菌免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要的組成部分。在細(xì)菌中，CRISPR的作用就像在人體細(xì)胞中的一把剪刀一樣，切割外來(lái)的DNA鏈。盡管科學(xué)家們已知道CRISPR在野外大約一半的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)到，但他們對(duì)CRISPR與入侵的病毒或噬菌體之間的分子戰(zhàn)爭(zhēng)知之甚少。

圖片來(lái)自Mulepati, S., Bailey, S.; Astrojan/Wikipedia/ CC BY 3.0。

在2018年7月19日同時(shí)在線發(fā)表在Cell期刊上的兩篇論文中，來(lái)自兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的研究人員提供了當(dāng)入侵含有CRISPR的細(xì)菌時(shí)，噬菌體彼此間進(jìn)行合作的證據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)為了壓制CRISPR的破壞，噬菌體通過(guò)聯(lián)合起來(lái)快速地感染細(xì)菌來(lái)加以適應(yīng)，而且有時(shí)一個(gè)噬菌體還會(huì)為此作為引火噬菌體（primer phage）犧牲自我。這兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)---來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校和英格蘭?？巳卮髮W(xué)----著重關(guān)注細(xì)菌和噬菌體之間基于CRISPR和抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR protein）的免疫關(guān)系。這兩篇論文的標(biāo)題為“Bacteriophage Cooperation Suppresses CRISPR-Cas3 and Cas9 Immunity”和“Anti-CRISPR Phages Cooperate to Overcome CRISPR-Cas Immunity”。

4.Nat Biotechnol：厄運(yùn)不斷，CRISPR/Cas9基因編輯竟導(dǎo)致大片段DNA缺失和重排
doi:10.1038/nbt.4192

根據(jù)一項(xiàng)新的研究，CRISPR基因編輯工具能夠?qū)е禄蚪M上的靶位點(diǎn)附近發(fā)生大片段DNA缺失和重排。這些變化能夠干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋，并且可能使得設(shè)計(jì)基于CRISPR的療法的努力復(fù)雜化。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月17日在線發(fā)表在Nature Biotechnology期刊上，論文標(biāo)題為“Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements”。

人們經(jīng)常利用CRISPR產(chǎn)生小片段DNA缺失，希望這樣能夠破壞一個(gè)基因的功能。但是在檢查CRISPR編輯時(shí)，Bradley和他的同事們發(fā)現(xiàn)了大片段DNA---通常長(zhǎng)數(shù)千個(gè)堿基---的缺失和復(fù)雜的DNA序列重排，這些重排導(dǎo)致之前相隔遙遠(yuǎn)的DNA序列被拼接在一起。這種現(xiàn)象在他們測(cè)試的所有三種細(xì)胞類型---小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠造血祖細(xì)胞和一種人分化細(xì)胞系---中都很普遍。

5.Mol Cell：揭示CRISPR/Cas9基因編輯為何有時(shí)會(huì)遭遇失敗
doi:10.1016/j.molcel.2018.06.005

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校的研究人員描述了為什么CRISPR基因編輯有時(shí)無(wú)法發(fā)揮作用，以及如何讓它更加地發(fā)揮作用。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月5日的Molecular Cell期刊上，論文標(biāo)題為“Enhanced Bacterial Immunity and Mammalian Genome Editing via RNA-Polymerase-Mediated Dislodging of Cas9 from Double-Strand DNA Breaks”。

在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員證實(shí)當(dāng)利用CRISPR進(jìn)行基因編輯遭遇失?。ù蠹s在15％的時(shí)間發(fā)生）時(shí)，這通常是由于Cas9蛋白持續(xù)地結(jié)合到DNA上，這會(huì)阻止DNA修復(fù)酶進(jìn)入切割位點(diǎn)。

進(jìn)一步的研究表明引導(dǎo)Cas9僅結(jié)合到DNA雙鏈中的一條鏈會(huì)促進(jìn)Cas9與RNA聚合酶之間的相互作用，從而有助于將無(wú)法發(fā)揮作用的Cas9轉(zhuǎn)化為一種的基因組編輯器。具體而言，他們發(fā)現(xiàn)在基因組編輯過(guò)程中，Cas9對(duì)DNA鏈的選擇保持一致性會(huì)迫使RNA聚合酶與Cas9碰撞，從而將Cas9從DNA上撞下來(lái)。

這些研究發(fā)現(xiàn)是非常重要的，這是因?yàn)樵诨蚪M編輯過(guò)程中，Cas9和DNA鏈之間的相互作用已知是一個(gè)“限速步驟”。這意味著它是這個(gè)基因組編輯過(guò)程中慢的部分；因此，這個(gè)步驟發(fā)生的變化有可能影響基因組編輯的總體持續(xù)時(shí)間。 

6.Nature：利用CRISPR改善化療藥物甲氨蝶呤的抗癌療效
doi:10.1038/s41586-018-0316-7

作為一種經(jīng)典的化療藥物，甲氨蝶呤（methotrexate）已在臨床上使用了將近70年。它的基本作用機(jī)制是*的。這種藥物抑制二氫葉酸還原酶（DHFR），其中DHFR是一種產(chǎn)生被稱作四氫葉酸（THF）的葉酸功能形式的酶。THF是制備核酸---比如攜帶細(xì)胞遺傳信息的DNA和參與蛋白表達(dá)的RNA---所需的原料所*的。細(xì)胞增殖必須復(fù)制它們的DNA，因此它們需要大量的THF，而且即便不發(fā)生分裂的細(xì)胞需要產(chǎn)生RNA，它們也需要THF。

圖片來(lái)自Lisa Nip/Whitehead Institute。

甲氨蝶呤經(jīng)常被用來(lái)治療一種被稱作急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的兒童白血病，而且當(dāng)作為一種多層面治療計(jì)劃的一部分時(shí)，它是高度有效的。但是這是有代價(jià)的。鑒于甲氨蝶呤不僅會(huì)損害癌細(xì)胞，而且也會(huì)損害健康組織，因此必須非常小心地使用它。對(duì)接受高劑量甲氨蝶呤治療（這是針對(duì)ALL的一種主流的治療方法）的兒童患者來(lái)說(shuō)，這可能意味著需要在醫(yī)院度過(guò)幾天以便接受嚴(yán)格的臨床監(jiān)測(cè)。

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)麻省理工學(xué)院懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所的David Sabatini、Sabatini實(shí)驗(yàn)室博士后研究員Naama Kanarek及其同事們開創(chuàng)性地利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)篩選參與甲氨蝶呤敏感性的因素。他們?nèi)〉玫囊唤M令人吃驚的發(fā)現(xiàn)指出組氨酸降解是癌細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤敏感的一種重要的決定因素。這一發(fā)現(xiàn)不僅有助于闡明甲氨蝶呤的生物學(xué)特性，而且也提示著一種簡(jiǎn)單的膳食補(bǔ)充劑可能有助于擴(kuò)大它的治療窗口和降低它的毒性。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月11日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Histidine catabolism is a major determinant of methotrexate sensitivity”。

如今，Kanarek開展的CRISPR/Cas9篩選結(jié)果進(jìn)一步有助于闡明甲氨蝶呤的分子機(jī)制。她和她的同事們發(fā)現(xiàn)另一種被稱作FTCD的酶也參與組氨酸降解。令人關(guān)注的是，F(xiàn)TCD也需要THF發(fā)揮它的功能，不過(guò)不同于作為甲氨蝶呤的主要靶標(biāo)的DHFR的是，F(xiàn)TCD并不是甲氨蝶呤的主要靶標(biāo)。盡管這兩種酶對(duì)THF存在著不同的需求，但是它們都從相同的THF庫(kù)中獲取它。

在正常情形下，這個(gè)THF庫(kù)是非常充足的，因此這兩種酶不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)THF資源，即便是在快速分裂的細(xì)胞中，也是如此。但是當(dāng)THF的數(shù)量有限---就像接受甲氨蝶呤治療的細(xì)胞中的那樣---時(shí)，情況就*不同了。就這種情形而言，F(xiàn)TCD的活性就存在嚴(yán)重的問題，這是因?yàn)門HF庫(kù)中沒有足夠的THF來(lái)支持細(xì)胞增殖和組氨酸降解。當(dāng)這種情形發(fā)生時(shí)，細(xì)胞就會(huì)死亡。

7.Science子刊：重大進(jìn)展！利用叛變的癌細(xì)胞清除原發(fā)性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥
doi:10.1126/scitranslmed.aao3240

假使癌細(xì)胞經(jīng)重編程后能夠抵抗它們自己的同類將會(huì)怎么樣？在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)布萊根婦女醫(yī)院和麻省總醫(yī)院的研究人員憑借基因編輯的力量使得利用癌細(xì)胞殺死癌癥取得關(guān)鍵性的進(jìn)展。他們?cè)诙喾N癌細(xì)胞類型的臨床前模型中報(bào)道了有希望的結(jié)果，這就為治療原發(fā)性癌癥、復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥建立了潛在的臨床轉(zhuǎn)化路線圖。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月11日的Science Translational Medicine期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPR-enhanced engineering of therapy-sensitive cancer cells for self-targeting of primary and metastatic tumors”。

這些研究人員開發(fā)出并測(cè)試了兩種利用癌細(xì)胞的這種自我歸巢能力的技術(shù)。種技術(shù)是一種“現(xiàn)成的”技術(shù)，它對(duì)治療抵抗性的癌細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使得它們能夠分泌死亡受體靶向配體（death receptor–targeting ligand），這就使得它們與患者的HLA表型（本質(zhì)上指的是人體的免疫指紋）相匹配，從而用于原發(fā)性癌癥臨床前模型中。第二種技術(shù)是一種“自體”方法，它利用CRISPR技術(shù)對(duì)來(lái)自患者的治療敏感性癌細(xì)胞進(jìn)行基因改造，從而敲除治療特異性的細(xì)胞表面受體，隨后再次對(duì)它們進(jìn)行基因改造，使得它們表達(dá)受體自我靶向配體（receptor self-targeted ligand），從而用于復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥的自體模型中。

為了測(cè)試這兩種方法，這些研究人員使用了原發(fā)性腦癌、復(fù)發(fā)性腦癌和已擴(kuò)散到大腦中的乳腺癌的小鼠模型。他們觀察到這些經(jīng)過(guò)基因改造的癌細(xì)胞直接遷移到腫瘤部位，并發(fā)現(xiàn)了這些癌細(xì)胞特異性地靶向并殺死小鼠體內(nèi)的復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的證據(jù)。他們報(bào)道這種治療可提高這些小鼠的存活率。此外，他們還給這些經(jīng)過(guò)基因改造的癌細(xì)胞配備上一個(gè)“殺死開關(guān)（kill switch）”。這個(gè)殺死開關(guān)在治療后能夠被激活，而且PET成像表明這個(gè)殺傷開關(guān)的作用清除這些經(jīng)過(guò)基因改造的癌細(xì)胞。 

8.重大進(jìn)展！在哺乳動(dòng)物中測(cè)試充滿爭(zhēng)議性的CRISPR基因驅(qū)動(dòng)技術(shù)
doi:10.1101/362558

一種有爭(zhēng)議的能夠改變整個(gè)物種基因組的技術(shù)已應(yīng)用于哺乳動(dòng)物中。在一項(xiàng)于2018年7月4日發(fā)表在bioRxiv預(yù)印本服務(wù)器上的研究中，來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校研究人員描述了利用CRISPR基因編輯在實(shí)驗(yàn)室小鼠中開發(fā)可能*有問題的動(dòng)物群體的“基因驅(qū)動(dòng)（gene drive）” 技術(shù)。

基因驅(qū)動(dòng)確保將經(jīng)過(guò)選擇的突變傳遞給動(dòng)物的幾乎所有后代。作為一種潛在的瘧疾控制策略，科學(xué)家們已在實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建出針對(duì)蚊子的基因驅(qū)動(dòng)。人們已提出了這種技術(shù)有助于殺死入侵的大鼠、小鼠和其他的嚙齒類動(dòng)物害蟲的可能性。這項(xiàng)新的研究澆滅了這種情形很快就會(huì)發(fā)生的希望。這種技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室小鼠中發(fā)揮的作用缺乏一致性，而且在人們考慮在野外使用這種工具之前，無(wú)數(shù)的技術(shù)障礙仍然存在著。

基因驅(qū)動(dòng)的作用機(jī)制是確保更高比例的有機(jī)體后代確定性地而不是偶然地遺傳某種“自私”基因，從而允許突變或外源基因在群體中快速地傳播。它天然存在于包括小鼠在內(nèi)的某些動(dòng)物體內(nèi)，這會(huì)導(dǎo)致它們死亡或不育。但是CRISPR-Cas9基因編輯工具已導(dǎo)致人們開發(fā)出合成基因驅(qū)動(dòng)，比如這種合成基因驅(qū)動(dòng)通過(guò)確保后代是不育的來(lái)清除野外的傳播瘧疾的蚊子等有問題的物種。

在這項(xiàng)新的研究中，由加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校發(fā)育遺傳學(xué)家Kim Cooper領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)并沒有嘗試開發(fā)讓實(shí)驗(yàn)室小鼠（Mus musculus）不育的基因驅(qū)動(dòng)。相反，Cooper團(tuán)隊(duì)的目標(biāo)是為這種技術(shù)創(chuàng)建一個(gè)也可能對(duì)基礎(chǔ)研究有用的測(cè)試平臺(tái)：它使得小鼠偏好遺傳一種導(dǎo)致它們產(chǎn)生白色毛發(fā)的突變。

基于CRISPR的基因驅(qū)動(dòng)利用這種基因編輯工具將一條染色體上的突變復(fù)制到與這條染色體配對(duì)的第二條染色體上，這通常是在動(dòng)物的早期發(fā)育期間開展的。當(dāng)Cooper團(tuán)隊(duì)在小鼠胚胎中嘗試這種方法時(shí)，這種突變并不總是被正確地復(fù)制，并且這種方法僅適用于雌性小鼠的胚胎。

Cooper團(tuán)隊(duì)估計(jì)，平均而言，這可能導(dǎo)致一種突變傳播到大約73％的雌性小鼠的后代，而不是大多數(shù)基因依據(jù)正常的遺傳規(guī)則有50%的幾率遺傳給后代。Cooper拒絕針對(duì)她的團(tuán)隊(duì)的研究工作發(fā)表評(píng)論，這是因?yàn)樗駷橹共⑽丛谕性u(píng)審的期刊上發(fā)表。

9.Nature：重大突破！無(wú)需病毒載體，利用電穿孔成功對(duì)人T細(xì)胞進(jìn)行CRISPR基因編輯
doi:10.1038/s41586-018-0326-5

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的研究人員在不使用病毒插入DNA的情形下對(duì)人T細(xì)胞（一種免疫細(xì)胞）進(jìn)行重編程。這一成就對(duì)研究、醫(yī)學(xué)和產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生重大的影響。他們期待他們的方法---一種快速的通用的經(jīng)濟(jì)的采用CRISPR基因編輯技術(shù)的方法---將會(huì)在新興的細(xì)胞治療領(lǐng)域中得到廣泛使用，加速開發(fā)出新的更加安全的治療癌癥、自身免疫疾病和其他疾?。òê币姷?/span>遺傳性疾?。┑寞煼?。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月11日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting”。

圖片來(lái)自Meletios Verras/iStock。

這種新方法提供了一種強(qiáng)大的分子“剪切和粘貼”系統(tǒng)，用于重寫人T細(xì)胞中的基因組序列。它依賴于電穿孔，即一種將電場(chǎng)施加到細(xì)胞上使得它們的細(xì)胞膜暫時(shí)地更具有滲透性。在一年內(nèi)試驗(yàn)了數(shù)千個(gè)變量之后，這些研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某些數(shù)量的T細(xì)胞、DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起然后暴露在一種適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)中時(shí)，這些T細(xì)胞將攝入DNA和CRISPR剪刀，并且地將特定的基因序列整合到CRISPR在基因組中的靶切割位點(diǎn)上。

論文通信作者、加州大學(xué)舊金山分校微生物學(xué)與免疫學(xué)副教授Alex Marson博士說(shuō)，“這是一種快速而又靈活的方法，可用于改變、強(qiáng)化和重編程T細(xì)胞，這樣我們就能夠給它們提供我們想要的特異性來(lái)清除癌癥、識(shí)別感染或者抑制自身免疫性疾病中觀察到的過(guò)度免疫反應(yīng)。”

10.Science：從結(jié)構(gòu)上揭示I型CRISPR-Cas系統(tǒng)降解靶DNA機(jī)制
doi:10.1126/science.aat0839 

作為流行的CRISPR 系統(tǒng)，I型CRISPR-Cas的特征是有序的靶標(biāo)搜索和降解。首先，多亞基監(jiān)測(cè)復(fù)合物Cascade（用于抗病毒防御的CRISPR相關(guān)復(fù)合物）識(shí)別相匹配的兩側(cè)具有前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）的雙鏈DNA靶標(biāo)，促進(jìn)CRISPR RNA（crRNA）和靶DNA鏈之間形成異源雙鏈體，并將非靶DNA鏈置換掉，從而導(dǎo)致在靶位點(diǎn)上形成R-環(huán)（R-loop）。隨后，將具有解螺旋酶活性和核酸酶活性的酶Cas3特異性地招募到Cascade/R-loop上并切割和漸進(jìn)性地降解靶DNA鏈。來(lái)自褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca, Tfu）的I-E型Cascade/R-loop和Cas3/單鏈DNA（ssDNA）復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)闡明了PAM識(shí)別和R-環(huán)形成機(jī)制。然而，Cas3招募、DNA切割和降解機(jī)制仍然是難以捉摸的。 

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)康奈爾大學(xué)和哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員重建出TfuCascade/R-loop/Cas3（即來(lái)自褐色嗜熱裂孢菌的Cascade/R-loop/Cas3）三元復(fù)合物，并利用單顆粒低溫電鏡技術(shù)（cryo-EM）解析出它在R-環(huán)切割前狀態(tài)和R-環(huán)切割后狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果 為理解I型CRISPR-Cas系統(tǒng)中crRNA指導(dǎo)的DNA降解提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月6日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Structure basis for RNA-guided DNA degradation by Cascade and Cas3”。

這些研究人員解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割前狀態(tài)下的分辨率為3.7埃的低溫電鏡圖。Cas3的結(jié)合不會(huì)引起形成R-環(huán)的Cascade復(fù)合物發(fā)生進(jìn)一步構(gòu)象變化，這提示著Cascade-Cas3相互作用在很大程度上是一種構(gòu)象捕獲機(jī)制而不是一種誘導(dǎo)契合機(jī)制。 Cas3-Cascade相互作用*是由Cascade中的Cse1亞基介導(dǎo)的。Cas3對(duì)Cascade的識(shí)別是由于與Cascade/R-loop在電荷和表面輪廓上是互補(bǔ)的，但與Cascade的種泡狀態(tài)（seed-bubble state）并不是互補(bǔ)的。這是因?yàn)樵赗-環(huán)充分形成之前，Cse1的C-末端結(jié)構(gòu)域處于一種替 代性方向。通過(guò)與Cse1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行廣泛接觸，Cas3能夠檢測(cè)Cse1的表面輪廓發(fā)生變化，從而排斥處于這樣的功能狀態(tài)下的Cascade。有條件地將Cas3招募到Cascade上就能夠避免錯(cuò)誤靶向僅具有部分互補(bǔ)性的DNA。

再者，這些研究人員提供了直接的證據(jù)表明一種底物移交機(jī)制對(duì)I-E型CRISPR干擾是至關(guān)重要的。Cas3的HD核酸酶結(jié)構(gòu)域直接捕獲非靶DNA鏈用于鏈切割，而且這種作用*繞過(guò)了它的解旋酶結(jié)構(gòu)域。這種底物捕獲依賴于非靶DNA鏈中存在的柔性凸起，而且這種切割位點(diǎn)偏 好性是由這種招募通路預(yù)先確定的。

這些研究人員進(jìn)一步解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割后狀態(tài)下的分辨率為4.7埃的結(jié)構(gòu)，這就允許他們鑒定出與這種鏈切割反應(yīng)相伴隨的結(jié)構(gòu)變化。這種結(jié)構(gòu)揭示出由于增加的柔性，R環(huán)區(qū)域中的完整非靶DNA鏈消失了。一旦腺苷5'-三磷酸（ATP）水解， 與PAM相鄰的一半非靶DNA鏈自發(fā)地重新定位到Cas3中的解旋酶結(jié)構(gòu)域的開口處。因此，在ATP水解時(shí)，Cas3的解旋酶結(jié)構(gòu)域讓非靶DNA鏈通過(guò)它自身并進(jìn)一步進(jìn)入Cas3的HD核酸酶結(jié)構(gòu)域，從而進(jìn)入一種漸進(jìn)性DNA降解模式。

11.Nat Commun：科學(xué)家成功將皮膚細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞
doi:10.1038/s41467-018-05067-x

我們的體內(nèi)含有多種類型的細(xì)胞，每一種細(xì)胞都扮演著不同的類型的角色，2012年諾貝爾獲獎(jiǎng)?wù)?mdash;日本科學(xué)家山中伸彌通過(guò)研究將成體皮膚細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化成了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（ipsC），這一過(guò)程稱之為重編程作用。

截止到目前為止，重編程過(guò)程僅可能引入關(guān)鍵的基因促進(jìn)細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)化，這種基因稱之為“山中因子”（Yamanaka factors），其能被被人工轉(zhuǎn)入到正常情況下并不具有活性的皮膚細(xì)胞中；近日，來(lái)自芬蘭赫爾辛基大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過(guò)激活細(xì)胞自身的基因，成功將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了多能干細(xì)胞，相關(guān)研究刊登于雜志Nature Communications上，文章中，研究人員利用基因編輯工具CRISPRa直接對(duì)細(xì)胞中相關(guān)的基因進(jìn)行了激活，他們利用了一種“鈍化”版本的Cas9剪刀，其并不會(huì)對(duì)DNA進(jìn)行切割，而是能在不對(duì)基因組進(jìn)行突變的基礎(chǔ)上來(lái)激活基因的表達(dá)。

研究者Otonkoski教授表示，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)能用來(lái)激活基因的表達(dá)，其在細(xì)胞重編程上能表現(xiàn)出巨大的潛力，因?yàn)槠湓谕粫r(shí)間里能對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行靶向作用，相比對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)作用，基于激活內(nèi)源性基因的重編程過(guò)程從理論上來(lái)講能夠以一種生理學(xué)的方式來(lái)控制細(xì)胞的命運(yùn)，同時(shí)還能產(chǎn)生較多正常的細(xì)胞；文章中，研究人員對(duì)CRISPR激活系統(tǒng)進(jìn)行了工程化修飾，使其能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行強(qiáng)大的重編程作用以產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

12.兩項(xiàng)研究表明利用CRISPR-Cas9基因組編輯有望治療α-1抗胰蛋白酶缺乏癥
doi:10.1089/hum.2017.225; doi:10.1089/hum.2017.227

在兩項(xiàng)開創(chuàng)性的概念驗(yàn)證研究中，兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)校正導(dǎo)致α-1抗胰蛋白酶（alpha-1 antitrypsin, AAT）缺乏癥的基因突變，成功地在α-1抗胰蛋白酶缺乏癥（AATD）模式小鼠的肝臟中進(jìn)行靶向基因校正，將低水平的正常AAT恢復(fù)到正常水平。 

在項(xiàng)研究中，來(lái)自美國(guó)馬薩諸塞大學(xué)、中國(guó)同濟(jì)大學(xué)和武漢大學(xué)的研究人員同時(shí)注射兩種腺相關(guān)病毒（AAV）載體：一種AAV載體用于運(yùn)送CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的Cas9組分；另一種AAV載體編碼靶向AAT的向?qū)NA（gRNA）并攜帶一種同源依賴性修復(fù)模板。相關(guān)研究結(jié)果于2018年5月14日在線發(fā)表在Human Gene Therapy期刊上，論文標(biāo)題為“In vivo Genome Editing Partially Restores Alpha1-Antitrypsin in a Murine Model of AAT Deficiency”。

圖片來(lái)自iStock/Meletios Verras。

在第二項(xiàng)研究中，來(lái)自美國(guó)Editas醫(yī)藥公司和圣路易斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員證實(shí)了一種基因敲降方法導(dǎo)致肝細(xì)胞中的有毒性的發(fā)生突變的AAT表達(dá)下降了98%以上，并且利用一種雙載體系統(tǒng)在靶突變位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了4％～5％的核苷酸校正。相關(guān)研究結(jié)果于2018年6月22日在線發(fā)表在Human Gene Therapy期刊上，論文標(biāo)題為“Amelioration of Alpha-1 Antitrypsin Deficiency Diseases with Genome Editing in Transgenic Mice”。

13.Mol Cell：封面文章解讀CRISPR-Cas系統(tǒng)蛋白所扮演的關(guān)鍵角色
doi:10.1016/j.molcel.2018.05.002

近日，一項(xiàng)刊登在雜志Molecular Cell上的研究報(bào)告中，來(lái)自喬治亞州立大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員通過(guò)研究深入闡明了深入闡明了基于RNA的病毒免疫系統(tǒng)—CRISPR-Cas的基本生物學(xué)機(jī)制。CRISPR-Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌能用來(lái)抵御病毒和其它外來(lái)“入侵者”的一種防御機(jī)制，當(dāng)細(xì)菌被病毒攻擊時(shí)，其就能將病毒DNA“切碎”并將入侵者的一部分DNA分子片段插入細(xì)菌自身的基因組，并以這種方式來(lái)記錄病毒的DNA，隨后細(xì)菌就會(huì)利用DNA制造RNAs，并將其同細(xì)菌的蛋白相結(jié)合，殺滅病毒的DNA。

研究者M(jìn)ichael Terns表示，相比研究如何利用CRISPR進(jìn)行治療或醫(yī)學(xué)用途而言，本文研究更多的是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的研究成果，這項(xiàng)研究是適應(yīng)性研究過(guò)程的特殊一步，即識(shí)別出病毒的特殊DNA序列，并將其整合到宿主的基因組中，為后代提供更多的免疫力。此前研究人員并不理解細(xì)胞如何識(shí)別病毒為外來(lái)入侵者，以及哪些細(xì)菌蛋白對(duì)于成功整合和提供免疫力是*的。這項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)研究闡明了細(xì)菌的免疫系統(tǒng)如何制造記憶分子來(lái)移除有害的病毒DNA序列，同時(shí)研究人員還揭示了這種特性是如何傳遞給細(xì)菌后代的。

通過(guò)分析相應(yīng)的數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)，此前鑒別出的特征不明顯的Cas4蛋白質(zhì)或許與CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Cas1和Cas2蛋白存在于一定的關(guān)聯(lián)，在初的適應(yīng)階段，其中一個(gè)Cas4蛋白能夠識(shí)別序列中的關(guān)鍵“信號(hào)占位符”，而這種序列距離分離的DNA序列較近。當(dāng)Cas1和Cas2、以及其中一個(gè)Cas4存在于細(xì)胞中時(shí)，其就會(huì)扮演基于隊(duì)伍的免疫系統(tǒng)“將軍”的角色，同均一尺寸的切斷DNA序列相互“溝通”，并且決定下一步的方向，給出終摧毀致命DNA分子片段的指令。

細(xì)胞為了成功識(shí)別并且去除DNA分子片段，其就會(huì)將這些DNA分子片段的信息摻入到自身的基因組中實(shí)現(xiàn)免疫效力，而且Cas4蛋白必須存在于細(xì)胞中并與Cas1和Cas2串聯(lián)起來(lái)。研究者Terns說(shuō)道，Cas4存在于許多CRISPR-Cas系統(tǒng)中，但這些蛋白質(zhì)所扮演的角色研究人員卻并不清楚，在細(xì)菌的免疫系統(tǒng)中，有兩種關(guān)鍵的Cas4蛋白對(duì)于控制上述過(guò)程非常關(guān)鍵，因此細(xì)菌的功能性RNA需要被制造出來(lái)并且被賦予相應(yīng)的免疫力。（生物谷 ）