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      新研究挑戰(zhàn)用于構建條件性基因敲除小鼠的CRISPR方法
    • 發(fā)布日期:2018-10-08      瀏覽次數(shù):1282
      • 在一項新的研究中,一個由17個實驗室組成的聯(lián)盟提供的結果與一項高度引用的研究[1]---它描述了一種利用CRISPR構建條件性基因敲除小鼠的技術---相矛盾。這項新的研究表明與那項原始的研究[1]相比,這種技術的效率要低得多。相關研究結果[2]于2018年9月1日發(fā)表在預印本服務器bioRxiv上,論文標題為“Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology”。

        這項新研究的結果指出了那項原始研究的局限性,后者取得的成功似乎被歸因為剔除雜合小鼠品系中的特定基因。根據(jù)谷歌學者(Google Scholar)的統(tǒng)計,那項原始研究被引用了將近1000次。它的主要作者堅持認為他的方法是強有力的。
         

        圖片來自bioRxiv, doi:10.1101/393231。

         

        在美國懷特黑德生物醫(yī)學研究所遺傳學家Rudolf Jaenisch及其同事們在2013年發(fā)表那項原始研究[1]之前,胚胎干細胞被用來制備條件性基因敲除小鼠---在需要缺失一個基因的情形下,動物的基因經(jīng)改造后被關閉---這個過程可能需要數(shù)年時間,成功率僅為1%。CRISPR技術提供一站式服務,它所構建出的條件性基因敲除小鼠的成功率為16%。通過將CRISPR復合物注射到受精卵中,Jaenisch團隊成功地將一個待剔除的基因放置在兩個LoxP位點之間,從而允許這個基因受到條件性調節(jié)。

        美國康奈爾大學干細胞與轉基因核心機構主任John Schimenti說(未參與這兩項研究),“Jaenisch發(fā)表的那項初研究是一個里程碑,它當然證實了你能夠在特定的位點上獲得非常的突變。”

        條件性基因敲除小鼠在生物醫(yī)學研究中是非常重要的,這是因為它們讓科學家們在有機體的特定組織中以及在發(fā)育期間的特定時間剔除必需基因。盡管Jaenisch開發(fā)的這種方法很有前景,但是試圖利用該技術構建出條件性基因敲除小鼠的研究團隊并沒有那么成功。

        Schimenti說,“所有試圖利用他們初提出的這種方法制備出的floxed等位基因(譯者注:在遺傳學中,floxed是‘flanked by LoxP’的縮寫,指的是將一個等位基因以三明治的形式放置在兩個LoxP位點之間。在Cre重組酶的催化下,兩個LoxP位點發(fā)生重組,從而剔除這兩個LoxP位點之間的等位基因。)通常都會遭遇失敗。”Schiment已在康奈爾大學干細胞與轉基因核心機構觀察到與這項新的研究提及到的“相同的問題”。

        Schimenti指出,Jaenisch開發(fā)的這種方法通常會導致脫靶突變,缺失或者無法以正確的方向插入兩個LoxP位點。他說,“這一點在科學界中得到普遍認可,簡言之,取得與Jaenisch團隊報道的成功率相相近的結果是非常困難的。” 

        在學術會議和其他地方,一個緊密結合的研究團體針對其他實驗室利用這種技術所面臨的挑戰(zhàn)開展的討論使得主管澳大利亞國立大學轉基因機構的Gaetan Burgio和他的同事們試圖確定出了什么問題。

        首先,三個實驗室在不同的小鼠品系中復制了這項靶向同一個基因的原始實驗,但沒有取得成功。接下來,包括這三個實驗室在內的17個實驗室在5種不同的小鼠品系中針對小鼠基因組中的總共56個基因和2個基因間區(qū)域獨立地重復這項實驗。來自所有這些實驗室的數(shù)據(jù)集經(jīng)合并后包括17887個顯微注射或電穿孔的小鼠受精卵和產(chǎn)生的1718只活小鼠,其中僅15只小鼠具有條件性對照所需的兩個插入的LoxP位點。在所有接受測試的小鼠中,觀察到脫靶的缺失或突變代替LoxP位點的正確插入。

        與那項原始研究在小鼠中獲得條件性敲除等位基因的效率為16%相比,Burgio和其他人的成功率僅為0.87%。Burgio說,“這種方法的成功率. . .相當于使用胚胎干細胞的經(jīng)典方法。”

        這17個實驗室旨在找出導致成功地構建出條件性基因敲除小鼠的潛在因素,結果發(fā)現(xiàn)同時插入兩個LoxP位點對這種技術的成功是至關重要的。

        Jaenisch認為這兩項研究中使用的小鼠品系之間的差異是癥結之所在,也是這兩項研究之間存在的很大差異的根本原因。Jaenisch對這項新研究的質量提出了質疑,“我不得不認為這些數(shù)據(jù)是不可靠的”。

        Schimenti對此表示贊同,認為在重復那項原始研究時應考慮遺傳背景。“我認為這是這項發(fā)表在bioRxiv上的研究存在的缺陷---如果他們測試Jaenisch的研究結果,他們應該使用*相同類型的動物。”不過,Burgio和Schimenti提出一點:相比于這項新的研究中使用的小鼠,Jaenisch使用的小鼠品系并不常見。

        Schimenti還提出了Jaenisch取得的16%成功率可能代表著那項原始研究中使用的特定小鼠品系中的單個基因座。Schimenti說,“我認為很明顯這是一個非常有問題的技術。還需要有一個解決方法。”(生物谷) 

        原始出處:
        Study Challenges CRISPR Method for Making Conditional Knockout Mice

        參考資料:
        1.Hui Yang,Haoyi Wang,Chikdu S. Shivalila et al. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell, 12 September 2013, 154(6):1370-1379, doi:10.1016/j.cell.2013.08.022

        2.Channabasavaiah Gurumurthy, Rolen Quadros, John Adams Jr. et al. Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology. bioRxiv, Published Online: 1 September 2018, doi:10.1101/393231

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