在廣泛使用的CRISPR/Cas9基因編輯工具中，核酸酶Cas9含有兩個具有切割活性的結(jié)構(gòu)域：HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域，其中HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈。RuvC結(jié)構(gòu)域可分為三個亞結(jié)構(gòu)域：RuvC I、RuvC II和RuvC III，RuvC I接近于Cas9的氨基端，RuvC II和RuvC III位于HNH結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)。僅對Cas9中的RuvC I進(jìn)行突變，具體而言就是讓RuvC I的兩個關(guān)鍵氨基酸殘基中的一個轉(zhuǎn)換成丙氨酸（D10A或H840A），從而得到Cas9切口酶（Cas9 nickase, Cas9n）。這種切口酶不能切割非互補(bǔ)DNA鏈，僅能切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈。如果同時讓Cas9中的這兩個結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，便可得到僅對DNA有結(jié)合活性但沒有切割活性的dCas9（nuclease-dead Cas9，沒有核酸酶切割活性的Cas9）。

CRISPR/Cas9是由一種原始的細(xì)菌免疫系統(tǒng)改編而成的，它的作用方式是首先在基因組的一個靶位點上切割雙鏈DNA。相比之下，堿基編輯并不切割DNA雙螺旋，而是在組成DNA或RNA的四個堿基中，利用酶地重新排列其中的一個堿基上的一些原子，從而將這個堿基轉(zhuǎn)化為一個不同的堿基，同時不改變其周圍的堿基。這種能力大大增加了改變遺傳物質(zhì)的選擇手段。2017年，通過堿基編輯器編輯技單個堿基技術(shù)入選2017年《科學(xué)》雜志“科學(xué)突破”。

1.Nat Med：堿基編輯器取得重大進(jìn)展！有望在產(chǎn)前治療先天性疾病
doi:10.1038/s41591-018-0184-6; doi:10.1038/s41591-018-0215-3

來自美國費城兒童醫(yī)院和賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的研究人員進(jìn)行產(chǎn)前基因編輯來阻止實驗室動物出現(xiàn)致命性的代謝障礙，從而有潛力在出生前治療人類先天性疾病。這就為在產(chǎn)前利用一種復(fù)雜的低毒的工具地對致病性基因中的DNA堿基進(jìn)行編輯提供了概念驗證。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年10月的Nature Medicine期刊上，論文標(biāo)題為“In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolic genes”。論文通信作者為賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的Kiran Musunuru博士 和William H. Peranteau博士。
 

圖片來自Nature Medicine, doi:10.1038/s41591-018-0184-6。

這些研究人員使用了基因編輯工具CRISPR-Cas9和第三代堿基編輯器（base editor 3, BE3）靶向編輯一種調(diào)節(jié)膽固醇水平的基因，從而降低了在子宮內(nèi)接受過這種治療的健康小鼠中的膽固醇水平。他們還在一小部分事先經(jīng)過基因改造而攜帶著導(dǎo)致一種致命性肝臟疾病---1型遺傳性酪氨酸血癥（hereditary tyrosinemia type 1, HT1）---的突變的小鼠中使用產(chǎn)前基因編輯來改善它們的肝臟功能和阻止新生小鼠死亡。

2.Nat Med：在體內(nèi)利用新型堿基編輯器有望治療遺傳疾病
doi:10.1038/s41591-018-0209-1; doi:10.1038/s41591-018-0215-3

苯丙酮尿癥（phenylketonuria）的病因是編碼苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase, Pah）的基因發(fā)生突變。這種由肝細(xì)胞產(chǎn)生的酶代謝苯丙氨酸。這種代謝障礙是一種“常染色體隱性”遺傳疾?。簝和绻麖哪赣H那里遺傳一個突變基因拷貝和從父親那里遺傳一個突變基因拷貝，那么就會患上這種疾病。到目前為止，這種疾病仍然是無法治愈的。

在一項研究中，來自瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院和蘇黎世大學(xué)的研究人員利用一種方法糾正肝細(xì)胞中的兩個突變基因拷貝，從而治愈這種疾病。他們在小鼠體內(nèi)取得了成功，。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年10月的Nature Medicine期刊上，論文標(biāo)題為“Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice”。論文通信作者為蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Gerald Schwank教授。

這種由胞苷脫氨酶（cytidine deaminase）加以強(qiáng)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合到這兩個需要被校正的基因拷貝上，并且在局部打開DNA雙鏈。胞苷脫氨酶將致病性的DNA堿基對C-G轉(zhuǎn)化為健康人體內(nèi)對應(yīng)基因組位點上存在的堿基對T-A。這能夠校正Pah酶編碼基因中的DNA堿基錯誤。通過這種方法，這些研究人員改變了成年小鼠中這兩個突變基因拷貝中的堿基序列。這些經(jīng)過校正的肝細(xì)胞能夠產(chǎn)生功能性的Pah酶，這些小鼠所患的這種疾病被治愈了。 

3.Cell子刊：我國科學(xué)家成功利用堿基編輯修復(fù)人胚胎中的致病性基因突變
doi:10.1016/j.ymthe.2018.08.007

來自中國廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院、中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所和上?？萍即髮W(xué)的研究人員利用一種改進(jìn)形式的CRISPR基因編輯技術(shù)來修復(fù)活的人胚胎中的遺傳缺陷。在近期發(fā)表Molecular Therapy期刊上的標(biāo)題為“Correction of the Marfan Syndrome Pathogenic FBN1 Mutation by Base Editing in Human Cells and Heterozygous Embryos”的論文中，描述了他們的研究工作和取得的進(jìn)展。論文通信作者為廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的劉見橋（Jianqiao Liu）教授和中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的黃行許（Xingxu Huang）教授。

圖片來自Molecular Therapy, doi:10.1016/j.ymthe.2018.08.007。

在三年前，一個中國研究團(tuán)隊利用CRISPR對人胚胎進(jìn)行編輯。該團(tuán)隊試圖利用這項技術(shù)修復(fù)人胚胎中的遺傳缺陷。雖然這在當(dāng)時成為世界各地的頭條新聞，但是它的成功率很低---在經(jīng)過這種技術(shù)編輯后存活下來的54個胚胎中，僅4個胚胎攜帶著成功得到修復(fù)的基 因。從那時起，人們就開發(fā)出一種新的被稱作堿基編輯的CRISPR變體，它以更有效的方式發(fā)揮作用。這種新方法不會切斷DNA鏈和利用攜帶著所需特征的DNA片段替換移除的DNA片段，而是僅僅改變DNA堿基---比如利用堿基G替換堿基A。在這項新的研究中，這些研究人員使 用這種新方法來校正導(dǎo)致人類患有馬凡綜合癥（Marfan syndrome）的基因突變，在這種疾病中，患者在FBN1基因上發(fā)生G→A突變。這是一種導(dǎo)致結(jié)締組織問題的疾病，而且給那些出生時就攜帶這種突變的人帶來無數(shù)的問題。

他們對18個胚胎進(jìn)行了基因編輯，并且在所有的這些胚胎中，事先設(shè)計好的堿基變換按照計劃發(fā)生。但是，在兩個胚胎中，其他的堿基也在無意中發(fā)生變換。他們聲稱他們的研究為這種堿基編輯技術(shù)提供概念驗證---在現(xiàn)實世界的體外受精診所中，有缺 陷的胚胎經(jīng)發(fā)現(xiàn)后會被丟棄。然而，他們確實承認(rèn)這個領(lǐng)域仍然是非常新的，而且在嘗試將這種技術(shù)用于允許發(fā)育成胎兒的胚胎中之前，還需開展更多的研究工作。

4.兩篇Protein & Cell報道我國科學(xué)家進(jìn)一步優(yōu)化腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)
doi:10.1007/s13238-018-0568-x; doi:10.1007/s13238-018-0566-z

來自中國華東師范大學(xué)和中山大學(xué)的兩個研究小組在小鼠和大鼠品系中開發(fā)出一種被稱作腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor, ABE）的堿基編輯系統(tǒng)，并對這種系統(tǒng)加以改進(jìn)，這將對人類遺傳疾病和基因療法帶來重大的影響。相關(guān)研究結(jié)果發(fā) 表在開放存取的Protein & Cell期刊上，論文標(biāo)題分別為“Increasing targeting scope of adenosine base editors in mouse and rat embryos through fusion of TadA deaminase with Cas9 variants”和“Effective and precise adenine base editing in mouse zygotes”。

人基因由堿基A、T、C和G組成，這些堿基以特定的順序排列在一起來編碼遺傳信息。這種ABE系統(tǒng)能夠產(chǎn)生所需的A→G轉(zhuǎn)化，因而允許科學(xué)家們改變遺傳密碼，同時讓不想要的結(jié)果zui小化。鑒于幾乎一半的人類遺傳疾病是由C/G→T/C突變引起的，這是通過ABE系統(tǒng)加 以校正，因此它是一種有前景的治療應(yīng)用技術(shù)。

在這兩項新的研究中，這些研究人員利用這種ABE系統(tǒng)地培育出三種小鼠品系來模擬一種被稱作杜氏肌營養(yǎng)不良（Dunchenne Muscular Dystrophy, DMD）的遺傳性肌肉變性疾病。他們還使用一種大鼠模型來模擬II型遺傳性糖原貯積病。這些模型可能是測試創(chuàng)新療法 （特別是基因療法）的重要資源。

5.重磅！Nature和Science同日打擂臺發(fā)表新型DNA/RNA堿基編輯器，可校正點突變
doi:10.1126/science.aaq0180; doi:10.1038/nature24644

自從5年前CRISPR熱潮開始以來，科學(xué)家們就競相開發(fā)這種強(qiáng)大工具的更加全面或的版本，從而能夠極大地簡化DNA編輯。本周發(fā)表在Science期刊和Nature期刊上的兩項研究進(jìn)一步擴(kuò)大了CRISPR的使用范圍，開發(fā)出一種更加微妙的被稱作堿基編輯（base editing）的方法來修復(fù)遺傳物質(zhì)：一項研究擴(kuò)展了一種編輯DNA的策略，而另一項研究通過對RNA進(jìn)行堿基編輯而開辟了新的領(lǐng)域。 

大量借用CRISPR工具包的堿基編輯系統(tǒng)很容易在非分裂細(xì)胞（nondividing cells）中實現(xiàn)堿基編輯。DNA具有4個核苷酸堿基：A、C、T和G，堿基編輯會將一個堿基改變?yōu)榱硪粋€堿基。在Liu的2016年那項研究中，他的團(tuán)隊將gRNA與一個“死的”Cas9（dCas9）融合在一起，dCas9不能夠切割整個DNA雙螺旋，但是仍然能夠在正確的位點上讓它解鏈。這些研究人員將酶APOBEC1附著到gRNA-dCas9上，這會觸發(fā)一系列化學(xué)反應(yīng)，終導(dǎo)致堿基C改變?yōu)閴A基T。DNA的堿基配對規(guī)則控制著隨后的堿基變化。這種配對規(guī)則規(guī)定一條DNA鏈上的T與另一條DNA鏈上的A配對。dCas9經(jīng)進(jìn)一步修飾后在未編輯的DNA鏈上產(chǎn)生切口，從而激活細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，將初始與堿基C配對的堿基G轉(zhuǎn)化為與這個新產(chǎn)生的T配對的A。

圖片來自 C. BICKEL/SCIENCE; (DATA) D. B. T. COX ET AL., SCIENCE 358, 6362, 2017；J. DOUDNA AND E. CHARPENTIER, SCIENCE 346, 6213, 2014; GAUDELLI ET AL., NATURE 551, 7677, 2017。

這個DNA堿基編輯器并不能夠解決與人類疾病相關(guān)的為常見的點突變（大約占一半）：在應(yīng)當(dāng)為G•C的地方存在著A•T。如今，來自Liu團(tuán)隊的這個新的編輯器能夠修復(fù)這種點突變。該團(tuán)隊再次將gRNA與dCas9融合在一起，但是已知沒有一種能夠?qū)轉(zhuǎn)化為G的酶。因此，他們利用來自大腸桿菌的酶TadA開出一種新型酶。這種新型酶將A轉(zhuǎn)化為一種被稱作肌苷（inosine, I）的堿基。隨后不論是一種細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，還是DNA自我復(fù)制過程，都會將I變成G。美國哈佛大學(xué)CRISPR研究員George Church說，“在這項研究中，重要的事情是對TadA酶進(jìn)行基因改造讓它具備某種非天然的功能。”

張鋒團(tuán)隊通過將gRNA與一種不同的沒有切割活性的核酸酶dCas13和一種將RNA中的A轉(zhuǎn)化為I的天然性酶融合在一起而構(gòu)建出一種RNA堿基編輯器。與DNA中不同的是，這不會導(dǎo)致隨后的堿基變化。含I的RNA僅像那個位點上存在一個G那樣發(fā)揮作用。

6.Nat Biotechnol：在人全基因組水平上證實基于CRISPR的單堿基校正是準(zhǔn)確的
doi:10.1038/nbt.3852

來自韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所（Institute for Basic Science, IBS）基因組工程中心的研究人員證實了一種近期開發(fā)的基因編輯方法的準(zhǔn)確性。這種基因編輯工具起著“DNA剪刀”的作用，旨在鑒定和替換人基因組（大小為30億個堿基對）中的僅一個核苷酸（或者說堿基）。這是在全基因組水平上驗證了這種“堿基編輯器（base editor）”的準(zhǔn)確性。這種驗證將有助擴(kuò)大這種方法在農(nóng)業(yè)、牲畜和基因療法中的應(yīng)用。相關(guān)研究結(jié)果于2017年4月10日在線發(fā)表在Nature Biotechnology期刊上，論文標(biāo)題為“Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases”。論文通信作者為來自IBS基因組工程中心的Seuk-Min Ryu和Jin-Soo Kim。

為了鑒定這種方法的可靠性，Kim團(tuán)隊對一種被稱作Digenome-seq的錯誤校驗技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，以便讓它適用于這種堿基編輯器方法。去年，當(dāng)該團(tuán)隊分析了CRISPR-Cpf1和CRISPR-Cas9的準(zhǔn)確性時，他們就使用和驗證了Digenome-seq。他們也改進(jìn)了計算機(jī)程序Digenome 2.0以便更加全面地鑒定脫靶位點，并且通過比較不同的gRNA發(fā)現(xiàn)降低脫靶編輯和增加特異性的gRNA。 

7.Nat Biotechnol：利用CRISPR培育出單核苷酸編輯轉(zhuǎn)基因小鼠
doi:10.1038/nbt.3816

人類DNA由大約30億個核苷酸組成。在某些情形下，僅一個核苷酸發(fā)生變化就能夠?qū)е聡?yán)重的疾病。科學(xué)家們希望利用一個正確的核苷酸替換這個不正確的核苷酸，從而治愈這些疾病。然而，利用當(dāng)前的基因編輯工具CRISPR-Cas9替換單個核苷酸存在技術(shù)上的挑戰(zhàn)。如今，在一項新的研究中，來自韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所（Institute for Basic Science, IBS）基因組工程中心的研究人員利用這種流行的基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9的一種變體版本培育出單核苷酸編輯小鼠。相關(guān)研究結(jié)果于2017年2月27日在線發(fā)表在Nature Biotechnology期刊上，論文標(biāo)題為“Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos”。

作為近年來出現(xiàn)的一種卓有成效的基因編輯技術(shù)，CRISPR-Cas9的作用機(jī)制是在DNA雙鏈中的一個發(fā)生突變的核苷酸附近進(jìn)行切割，切除一小段DNA序列。相反，IBS研究人員采用Cas9蛋白的一種變體：切口酶Cas9（nickase Cas9, nCas9），同時讓Cas9與一種被稱作胞苷脫氨酶（cytidine deaminase, CD）的蛋白融合在一起。CRISPR-nCas9-CD能夠?qū)⒁环N核苷酸替換另一種核苷酸，因而也被稱作堿基編輯器（Base Editor）。2016年，美國哈佛大學(xué)的David Liu團(tuán)隊和日本神戶大學(xué)的Keiji Nishda團(tuán)隊已開發(fā)出這種類型的脫氨酶，并且在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中進(jìn)行過測試。IBS研究人員通過將這種技術(shù)用于小鼠胚胎中，進(jìn)一步推動它的發(fā)展。 

IBS研究人員在小鼠體內(nèi)測試了CRISPR-nCas9-CD是否能夠校正Dmd基因（編碼抗肌萎縮蛋白）或Tyr基因（編碼酪氨酸酶）中的單個核苷酸。他們在這兩種基因中都取得成功：由Dmd基因發(fā)生單核苷酸突變的胚胎發(fā)育而成的小鼠在它們的肌肉中不產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白（dystrophin），而Tyr基因發(fā)生單核苷酸突變的小鼠表現(xiàn)出白化性狀。抗肌萎縮蛋白確實與肌肉肌營養(yǎng)不良疾病相關(guān)聯(lián)，而酪氨酸酶控制黑色素產(chǎn)生。

8.Science：利用改進(jìn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和特異性地實現(xiàn)單堿基突變
doi:10.1126/science.aaf8729

利用一種引入DNA單個核苷酸變化的脫氨酶，來自日本神戶大學(xué)的研究人員構(gòu)建出一種改進(jìn)的CRISPR/Cas9工具，從而避免產(chǎn)生有害的雙鏈斷裂，使得利用CRISPR/Cas9技術(shù)引入的附帶突變小化，而且也不需要加入DNA模板。相關(guān)研究結(jié)果于2016年8月4日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems”。

為了構(gòu)建一種更加準(zhǔn)確的編輯工具，Kondo和他的同事們將一種沒有核酸酶活性的不能夠切割雙鏈DNA的Cas9版本或一種產(chǎn)生單鏈切口的切口酶Cas9版本與一種來自七鰓鰻（sea lamprey）免疫系統(tǒng)的激活誘導(dǎo)性胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起。在正常情形下，這種AID酶在免疫球蛋白和抗體基因中產(chǎn)生突變從而讓免疫系統(tǒng)具有多樣性。AID作用在單鏈DNA上，將胞嘧啶（C）替換為尿嘧啶（U），隨后在一輪DNA復(fù)制中，這種尿嘧啶（U）被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T）。

通過測試這種新的雜合復(fù)合物是否能夠在出芽酵母---缺乏一種內(nèi)源性的類似AID的系統(tǒng)---中修飾一種選擇性的標(biāo)志物，Kondo團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)當(dāng)在向?qū)NA（gRNA）的引導(dǎo)下，這種蛋白復(fù)合物靶向作用于CAN1基因，而且相對于非靶向的選擇性標(biāo)志物，CAN1基因發(fā)生突變的頻率增加了1000倍。利用全基因組測序，研究人員發(fā)現(xiàn)很少的脫靶突變，只比背景突變率略有增加。論文作者、Kondo實驗室博士后研究員Keiji Nishida說，“[在AID存在下]，這種脫靶突變率是可以接受的，相比于自然的背景突變率增加了不到10倍。”（生物谷 ）